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【识林社区专题】液相色谱技术系列问答和讨论
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【识林社区专题】液相色谱技术系列问答和讨论
2025-03-22
识林社区是面向所有识林用户的互动交流平台。在这里，识林用户提出问题，同时也解答问题，并参与讨论。近期识林PC端上线【液相色谱技术】专题系列问答，用户们可围绕液相色谱的理论基础、实际应用、技术优化以及法规要求等展开讨论。
以下仅为近期部分问答，欢迎用户登录识林社区参与专题问答和讨论。
Q1：申报注册中，方法开发、验证和检验提供图谱时，液相气相图谱的量程有要求吗？
@用户bvyc
建议：
目前申报注册的图谱提供要求在2016年第80号文中有提到（如下），关于具体的量程要求并无明确，可根据实际检测项情况，如有关物质、含量等峰不同项目设计不同的量程。
80号文要求：
药品注册申报资料所附的色谱数据和图谱的纸面文件可参照原国家食品药品监督管理局药品审评中心发布的《药品研究色谱数据工作站及色谱数据管理要求（一）》的相关内容准备，建议对每项申报资料所附图谱前面建立交叉索引表，说明图谱编号、申报资料中所在页码、图谱的试验内容。
用于准备药品注册申报资料的色谱数据的纸面文件应采用色谱数据工作站自动形成的输出文件形式，内容应包括如下相关信息：
（1）标明使用的色谱数据工作站，并保留色谱数据工作站固有的色谱图谱头信息，包括：实验者、试验内容、进样时间、运行时间等，进样时间（指injection time）精确到秒，对于软件本身使用 “acquired time”“作样时间”“试验时间”等含糊表述的，需说明是否就是进样时间。
（2）应带有存盘路径的数据文件名。这是原始性、追溯性的关键信息，文件夹和文件名的命名应合理、规范和便于图谱的整理查阅。
（3）色谱峰参数应有保留时间（保留到小数点后三位）、峰高、峰面积、定量结果、积分标记线、理论板数及其他系统适用性要求的参数等。申报资料的色谱数据的纸面文件还应包括色谱数据的审计追踪信息（如色谱数据的修改删除记录及原因）。
依据：
总局关于发布化学药品新注册分类申报资料要求（试行）的通告（2016年第80号）
药品研究色谱数据工作站及色谱数据管理要求（一）
思考：
通常仪器自带固定量程，如果是首次接触，可以与供应商交流建立合适的量程模板，主要目的是为了能让审评老师清楚看出峰形。
Q2：液相系统RSD的修约规则有只进不舍的说法吗？出自哪里？
@夏博良
在液相色谱分析中，RSD（相对标准偏差）是一项用来评估测量精度的指标。
关于RSD的修约规则，通常有两种说法：
- 一种是“只进不舍”，即对于RSD的计算结果，只保留小数点后第二位，并进行四舍五入。例如，计算得到的RSD为1.2345%，则修约后的结果为1.23%。
- 另一种是“只舍不进”，即对于RSD的计算结果，直接保留小数点后第二位，并向下取整。例如，计算得到的RSD为1.2345%，则修约后的结果为1.23%。
具体采用哪种规则应该根据实验室的具体情况和标准规范进行选择。
@牧魂
针对这个问题，大家可以查看《中国药品检验标准操作规范》，但是不同的版本有差异，在2010版有相关明确规定，只进不舍的规定。但是在2019年版这没有这样的条款，也就是不做强制规定了。
即参考其他修约方式进行修约即可。
Q3：HPLC化合物手性异构体分离
@寒星苍梧
1.理论分析
手性异构体要分为对映异构体和非对映异构体，定义在有机化学教科书中都有，CDE的手性药物质量控制研究技术指导原则中也有两者的定义：
- 对映异构体（Enantiomers）：其分子为互相不可重合的镜象的立体异构体。
- 非对映异构体（Diastereoisomers）：对于分子中具有二个或多个不对称中心，并且其分子互相不为镜象的立体异构体，常简称为“非对映体”。
对映异构体在非手性环境中的性质基本相同，但在手性环境如与手性试剂的反应时性质不相同。而非对映异构体的许多物理和化学性质就不相同。因此可以说非对映异构体虽然是手性异构体，但其区分难度要比对映异构体低不少。因此在有机化学里已经有一个经验之谈：非对映异构体用非手性HPLC甚至TLC都可以分离开，但对映异构体只能用手性方法拆分开。
2.指导原则依据
在手性药物质量控制研究技术指导原则中也有类似的描述：
- 理论上，非对映异构体之间可采用非立体专属性的方法进行分离检测，故以下仅针对对映异构体杂质的检测方法进行阐述。从方法的专属性及灵敏度考虑，一般多采用手性分离的方法检测对映异构体。
因此，如果你要做分析的药品主成分和某杂质之间是对映异构体关系，一般只能用手性方法分离。如果主成分和某杂质之间是非对映异构体关系，就可以考虑用普通的反相色谱柱分离。
但手性分离并不意味着就一定是用手性色谱柱。具体以下同样引用指导原则的描述：
- 色谱法拆分药物对映体可分为直接法和间接法两类。直接拆分法是指不经衍生化而直接分离对映体药物，可以分为手性固定相（Chiral Stationary Phase, CSP）法和手性流动相添加剂（Chiral Mobile Phase Additive, CMPA）法。前者是将手性源合成到普通固定相上，形成手性固定相。虽然手性固定相的制备有一定难度，且手性柱通用性差、供试品有时需作柱前衍生化处理等，但是该法的色谱系统稳定性好、方法重现性较好、使用方便，所以在手性药物的研究中应用较多。后者是在流动相中加入手性选择剂而在普通色谱柱上分离手性化合物，其优点是可采用普通的非手性柱、操作简便、分析过程较少发生消旋化；通过改变CMPA的种类、浓度及流动相组成等多种途径可优化分离条件，并控制出峰顺序。该方法的缺点是其色谱系统稳定性较差，平衡时间较长，CMPA消耗较多，某些CMPA欠稳定，且有时干扰检测；CMPA有时需要自行合成，不如手性固定相法方便。但因其制备难度小于CSP，在进行手性药物前期研究时，因不易获得商品化的CSP，本法仍有较高的应用价值。间接拆分法主要是指手性试剂衍生化法（Chiral Reagent Derivatization,CRD），其原理主要是利用对映体混合物在预处理或前置柱中先与高光学纯度的手性衍生化试剂反应，生成一对非对映体，然后利用他们在理化性质上的差异，在非手性柱（也可用手性柱）上加以分离。此法涉及供试品的化学转化和分离等预处理过程，有时可引起某一对映体组分的消旋化、损失或富集，且手性衍生化试剂的光学纯度及衍生化反应的速率或收率等都会影响分析结果的准确性，研究中应加以关注。
3.实践角度
由于现在的色谱柱厂家已经开发出了很多手性色谱柱，而且也都有对适合分离的结构的摸索。所以选择手性柱进行方法开发的速度会是最快最省事的，而且也不用考虑样品成分受其他因素的影响。而如果想省成本用非手性柱进行分离，无论是在摸索加入流动相的手性选择剂还是衍生化方法，都要面临引入新物质和样品中主成分和杂质之间的作用和干扰等，会需要比手性柱使用更多的后续研究。
Q4：有的实验为什么有机相用到了甲醇和乙腈，而不是只用一种有机相？
@不住
1.调节选择性
分离机制差异：乙腈和甲醇与固定相的相互作用不同，混合使用可改变溶质在流动相和固定相之间的分配平衡，从而调整色谱峰的选择性。
案例：某些极性相近的化合物在纯乙腈中无法分离，但加入甲醇后可能通过氢键或偶极作用改变保留行为，提高分离度。
2.优化峰形和灵敏度
减少拖尾：甲醇的质子溶剂性质可抑制酸性或碱性化合物的离子化，减少峰拖尾（例如蛋白质或多肽分析）。
质谱兼容性：乙腈的离子化效率通常高于甲醇，但在某些情况下，混合溶剂可改善电喷雾离子化（ESI）的效率（如乙腈:甲醇=50:50）。
3.平衡洗脱能力和系统压力
高洗脱能力 + 低黏度：乙腈的强洗脱能力可缩短分析时间，但其低黏度可能无法有效控制柱压；加入甲醇可适当增加黏度，避免超高压系统（如UHPLC）的柱压过高。
案例：梯度洗脱中，起始高乙腈比例快速洗脱非极性组分，后续增加甲醇比例以平衡柱压和分离效果。
4.方法开发的灵活性
筛选条件：在方法开发阶段，混合溶剂可快速探索不同选择性，节省优化时间。
兼容复杂样品：对于含多种极性成分的样品（如天然产物提取物），混合溶剂可提供更宽的极性覆盖范围。
5.经济性和安全性
成本控制：乙腈价格较高，混合使用可降低溶剂消耗成本。
毒性管理：减少乙腈比例可降低实验人员的健康风险
Q5：仪器掉线都是软件引起的吗？
@华谱科仪
在液相色谱（HPLC/UHPLC）等仪器的使用过程中，模块或软件“掉线”（通信中断、控制失效）是常见问题。但并不是所有的掉线问题都是由软件引起的，可以从不同场景分析可能原因。
下面提供一些常见的掉线排查思路：
常见掉线场景及可能原因
1.仪器开机后无法连接
可能原因：
- - 硬件连接异常（USB/网线松动、接口氧化）。
- - 电源未稳定（模块未完全启动）。
- - 软件驱动未正确安装或版本不兼容。
- - 防火墙/杀毒软件拦截通信。
排查方案：
- - 重新插拔通信线（USB/网线/RS-232），检查接口氧化或损坏。
- - 更换备用线缆，排除线路故障。
- - 确认模块电源指示灯状态（如电源是否正常）。
- - 重启控制软件及电脑，清除临时错误。
- - 检查设备管理器中的驱动状态（如黄色感叹号提示）。
- - 更新或重装仪器驱动和软件补丁。
- - 关闭防火墙/杀毒软件，测试是否为拦截导致。
2.运行过程中突然掉线
可能原因：
- - 通信线路受干扰（电磁干扰、线路老化）。
- - 模块过热（柱温箱、检测器温度异常）。
- - 电源波动或断电（UPS失效）。
- - 软件崩溃（内存泄漏、系统资源不足）。
排查方案：
- - 检查实验室电源稳定性（使用万用表或UPS监测）。
- - 排除大功率设备（如离心机、烘箱）的电磁干扰。
- - 确保模块散热正常（清理风扇灰尘，检查通风
- - 重新插拔通信线（USB/网线/RS-232），检查接口氧化或损坏。
- - 更换备用线缆，排除线路故障。
- - 检查电脑资源管理情况（内存、CPU、磁盘占用情况）。
- - 检查软件使用记录（日志、信息中心等记录）。
3.模块掉线（如进样器、检测器）
可能原因：
- - 模块电源故障。
- - 模块固件损坏或未更新。
- - 通信端口配置错误（如网关、地址冲突）。
排查方案：
- - 执行模块自检功能（如泵、进样器的初始化）。
- - 检查固件版本是否与软件兼容，必要时升级固件。
- - 重置模块通信参数（如网关、IP地址）。
- - 将该模块连接到其他端口或电脑，测试是否正常。
- - 检查模块日志文件（如有）中的错误代码。
4.长时间运行后间歇性掉线
可能原因：
- - 散热不良导致模块过热。
- - 软件或系统内存泄漏。
- - 网络通信不稳定（如Wi-Fi或局域网干扰）。
排查方案：
- - 监控系统资源（CPU、内存占用）是否超负荷。
- - 使用网络抓包工具（如Wireshark）分析通信丢包。
预防措施
1.定期维护：清洁接口、检查线缆老化、更新软件/固件。
2.稳定环境：配备稳压电源、UPS，避免温度剧烈波动。
3.记录日志：保存软件报错信息，便于追溯问题。
4.备份配置：保存仪器通信参数和校准文件。
总结
掉线问题需结合现象逐步缩小范围：
- 物理连接 → 软件驱动 → 环境干扰 → 硬件故障。
对于复杂问题，建议联系厂商技术支持并提供以下信息：
- - 掉线时的操作步骤、错误代码、日志文件。
- - 已尝试的排查方法及结果。
通过系统化排查，可显著减少停机时间并提高实验效率。
Q6：2025版药典高效液相色谱法会有哪些变化？
@Stark
2025年版《中国药典》四部理化分析通用技术要求增修订概况中提到修订 0512高效液相色谱法，完善色谱参数调整范围，增加滞留体积对梯度分离影响的描述，增加溶液制备的描述，对系统适用性试验进行修订和补充，在测定法中增加标准曲线测定法。具体可以参照识林的药典会 关于0512 高效液相色谱法标准草案的公示 2023.09.14
@红秀
可以参考药典会 关于0512 高效液相色谱法标准草案的公示 2023.09.14与药典委文献。
Q7：市场上可选择的色谱柱品类这么多，什么样的色谱柱才是“好用”的色谱柱？
@漆白雪黑
色谱柱的“好用”通常包括几个方面：分离效果、稳定性、使用寿命、操作便利性和成本。
分离效果要看柱效、选择性和分离度。稳定性涉及批间重现性和耐受性，比如pH和温度范围。
使用寿命则与填料的耐用性和抗污染能力有关。
操作便利性可能包括是否容易更换、平衡时间长短。
成本不仅是购买价格，还有维护和更换频率。
分离效果
- 柱效（理论塔板数，N值）：柱效越高，峰形越尖锐，分离能力越强。
- 选择性（α值）：固定相与目标化合物的相互作用需能区分结构相近的组分。
- 分离度（Rs）：需满足分析方法要求（通常Rs≥1.5）。
稳定性与重现性
- 批间重现性：不同批次的色谱柱性能差异需极小（如保留时间偏差<2%）。
- 耐受性：耐受pH范围宽（如反相柱pH 1-12）、高温（如>60℃）或高比例有机相。
使用寿命
- 填料稳定性：硅胶基质抗水解能力或杂化颗粒的耐用性。
- 抗污染能力：耐受复杂样品基质（如生物样品、脏样品），避免柱压快速升高或柱效下降。
其他问题
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必读岗位及工作建议： - QA：确保色谱方法的合规性，监控系统适用性试验结果。
- 分析研发（R&D）：开发和验证高效液相色谱方法，确保方法的准确性和重复性。
- 注册：在药品注册文件中准确描述色谱方法，确保符合监管要求。
适用范围：
本文适用于化学药品的质量控制，包括原料药和制剂。适用于中国药典的相关规定，主要面向大型药企、Biotech公司以及CRO和CDMO等企业。 要点总结： - 色谱柱选择与性能：强调色谱柱内径、长度、填充剂粒径等对分离效果的影响，规定了色谱柱选择的依据和条件。
- 检测器类型与要求：明确了紫外-可见分光检测器等常用检测器的选择性与通用性，以及对流动相的不同要求。
- 流动相系统：规定了反相和正相色谱系统的流动相组成，以及缓冲溶液和有机溶剂的使用比例。
- 色谱参数调整：允许在一定范围内调整色谱参数，如流速、进样体积等，以优化分离效果，同时强调调整后需验证系统适用性。
- 系统适用性试验：包括理论板数、分离度、灵敏度等，用以评估色谱系统的性能，确保分析结果的准确性和重复性。
以上仅为部分要点，请阅读原文，深入理解监管要求。 岗位必读建议： - QA：确保实验室操作符合新修订的高效液相色谱法标准。
- 分析研发（R&D）：了解修订内容，更新分析方法以符合新标准。
- 注册：关注公示期，及时反馈意见，确保注册文件的更新。
适用范围说明：
本文适用于所有使用《中国药典》的药品生产企业，包括化学药、生物制品、疫苗、中药等，主要针对药品的分析方法标准。发布机构为中国药典委员会，适用于各类企业，包括Biotech、大型药企、跨国药企、CRO和CDMO等。 文件要点总结： - 公示修订草案：《中国药典》0512高效液相色谱法的修订草案正在进行第二次公示，征求社会各界意见。
- 公示期限：公示期为30天，自2023年9月14日至10月15日。
- 反馈要求：若有异议，需在公示期内提交书面反馈，包括相关说明、实验数据，并提供联系方式。
- 反馈形式：相关单位反馈需加盖公章，个人反馈需签名，并上传电子版至指定附件中。
- 默认同意：公示期满未回复意见即视为对公示标准草案无异议。
以上仅为部分要点，请阅读原文，深入理解监管要求。 |
