首页 > 资讯 > PDA 细胞产品冻存实践现状调研分析

出自识林

2020-09-23

第一批成功的冻存研究是在 1949 年开展的[1]，此后，许多策略被提出并予以采纳，来促进冻存后细胞功能的快速复苏。但可惜的是，尽管经过数十年的研究并在临床上得到了越来越多的重视，但目前仍没有针对细胞和基因治疗药物（先进治疗产品或 ATMP）协调一致的冻存标准，并且在商业和学术团体之间甚至团体内部的冻存方案仍存在很大差异。

为解决当前使用冻存方案的现状，美国非肠道 药协会（PDA）设计并分发了“冻存实践和经验”调研问卷，以供 PDA 成员分享他们与生物处理实践有关的经验，调研结果总结如下。 调研分为总体概况，有关细胞库生成和监测的内容以及与故障排除和解决方案有关的问题。

由于 32% 受访者的产品冻存与在冷藏温度下的非冷冻贮存和运输混在一起使用，因此除非另有说明，否则调研将采用“生物贮存（biopreservation）”一词。

总体而言，生物贮存主要被纳入到产品商业化活动（38%），其次是临床活动（31%）和研究活动（24%）。

受访者之间的贮存温度差异很大，反映了生物制品处理要求的多样性，其中最常见的是液氮（LN₂ ，-196 °C to -140 °C）（42%），其次是 -80 °C （30%）和 2–8 °C （12%）。实际上，只有温度低于水的玻璃化转变温度[Tg ~-135 °C][2]可以完全阻滞分子运动，并使细胞长期贮存在库中[3]。高于 Tg 的贮存温度将存在逐渐溶解，并且应仅用于细胞产品的短期贮存解决方案。

尽管保持温度很重要，但仍有许多受访者（50%）仅对最终细胞产品进行生物贮存，而对进场生物源材料不进行生物贮存（24%）。没有适当生物贮存控制措施的进场细胞物料可能会遭受明显的细胞损失或功能降低，这可能会对下游生产和终产品的效价产生不利影响[4]。温度偏移最常见的是使用数据记录器记录（52%）或通过数据记录器和实时监控的组合进行监测（30%）。大多数生物贮存的物料都在装有干冰（~-80 °C）或湿冰的隔热保温运输箱中运输（72%）。

在商业和研究实践中，大多数细胞库都是以自我认定的“低密度”（69%）细胞浓度（<2 x 10⁷ 细胞/mL 密度）在塑料冷冻管形式（67%）中贮存。大多数受访者在对于给定细胞类型的冻存方案优化期间至少执行了某种形式的“实践”库（57%）。在大多数受访者中，容器密封的完整性方案相差很大，但主要集中于染色法。同样，冻存的时间长度从速冻（液氮浸入）到 8 小时缓慢冷却不等。而且，虽然通常不会将过程暂停步骤作为工作流程的一部分进行验证（65%），但绝大多数（73%）执行了稳定性研究，以确保低温保存过程不会影响样品的完整性。

尽管可以使用商业生物贮存介质，但许多受访者仍将商业介质与内部配制的介质结合使用（42%），单独使用商业介质的受访者中（30%），大多会针对每种细胞专门优化商业介质（78%）。当选择商业介质时，主要是按照 GMP 指南生产的（86%）。商业冻存介质很大部分不含动物/人蛋白质（54%），并使用二甲基亚砜（DMSO）作为主要冷冻保护剂（85%）。基于液氮的控速冷冻设备是最常见的样品冷冻方法（43%），尽管主要采用通用协议（55%）而没有在指定温度下强制冰成核的最佳冷冻速率（64%）。对于 76% 的受访者，通常在干冰的帮助下将冷冻样品从冷冻设备移植气相液氮，以在转移过程中将温度保持在 <-80 °C。冻存的样品主要使用手动方法（76%）在某种形式的水浴中解冻。冻存介质大多在给患者用药前通过离心或洗涤从样品中除去（52%），尽管许多受访者报告表示冻存介质已被证实可作为辅料输注，即无需清洗（48%）。解冻后的活力和功能性确定针对各产品有所不同，但大多数受访者（91%）认为，在多个细胞库解冻中，冻存活性可成功超过 75%。

这项调研提供了有关生物制药和细胞治疗药物生产方面生物贮存现状的宝贵见解。总而言之，受访者之间的生物贮存实践差异很大，既反映了临床产品开发中细胞使用的相对不足，也反映了监管机构和专业组织冻存标准的缺乏。尽管如此，仍能从 PDA 的冻存调研中推测出几个共同点。

在实践中，生物贮存被商业团体广泛采纳，作为终产品配置的一部分，使用基于液氮的基础设施在冷冻温度下用于贮存和运输。程序上，使用基于液氮的冷冻箱进行冻存，并使用水浴手动解冻样品。

反映出需要适当的质量保证，大多数受访者使用的商业冻存介质是在 GMP 下生产的，不含动物或人类蛋白质，并含有 DMSO 作为主要冷冻保护剂。最后，解冻后的细胞活力主要由膜的完整性决定，解冻后立即测量 >75% 基准，但是方法和功能性测量对于每个组织和每件申请都是特定的。

尽管存在这些明显共性，但也发现了一些潜在缺陷，可能会降低细胞在贮存后的健康状况和有效性。引发关注的主要原因是，当前的实践主要只关注终产品，而不是整个产品生命周期（包括在创建关键的主细胞库和工作细胞库时）都将适当的生物贮存控制作为连续体纳入其中。对于进场生物原料尤其如此，对生物原料的不正确贮存可能导致过度降解，并可能影响产品工作流程中所有后续的下游步骤。

实际上，质量差的细胞起始物料可能会传播不良的遗传特性，从而可能对下游加工的各个方面产生负面影响并损害最终细胞产物。当前实践中有很大缺失的其它生物贮存方案可能会改善解冻后细胞的健康状况和功能，包括但不限于特定于细胞的冷冻/解冻速率，包含生物贮存前的保温步骤，添加冷冻保护剂的温度和调节冰成核[4]。对这些变量的控制不充分可能会导致样本变异性过大和解冻后功能受损。实际上，超过一半的受访者（52％）由于不明原因（69％）而至少经历了一次解冻后细胞功能不良事件，这强调了在整个生产过程中，从进场原始物料到终产品用于患者中进行适当的生物贮存控制的重要性。

PDA 召集了一个工作组将当前冻存的最佳实践汇编成一份参考文件，题为“, Cryopreservation of Cells for Use in Cell Therapies, Gene Therapies, and Regenerative Medicine Manufacturing: An Introduction and Best Practices Approach on How to Prepare, Cryopreserve, and Recover Cells, Cell Lines, and Cell-Based Tissue Products ”于 2020 年 7 月提交作为美国国家标准协会（ANSI）的标准。

参考资料

[1] Polge C, Smith AU, Parkes AS. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature. 1949;164(4172):666. doi:10.1038/164666a0

[2] Chen T, Fowler A, Toner M. Literature review: Supplemented phase diagram of the trehalose-water binary mixture. Cryobiology. 2000;40(3):277-282. doi:10.1006/cryo.2000.2244

[3]Hubel A, Spindler R, Skubitz APN. Storage of Human Biospecimens: Selection of the Optimal Storage Temperature. Biopreserv Biobank. 2014;12(3):165-175. http://online.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/bio.2013.0084.

[4]Hawkins BJ, Abazari A, Mathew AJ. Biopreservation Best Practices for regenerative medicine GMP manufacturing & focus on optimized biopreservation media. Cell Gene Ther Insights. 2017;3(5):345-358. doi:10.18609/cgti.2017.035

编译自：PDA Survey Results: Current State of Cryopreservation by Brian J. Hawkins, Raluca Marcu, Pluristyx, Inc.