首页 > 资讯 > 全球6家监管实验室验证亚硝胺杂质检测方法，FDA发文提供具体方法参数

出自识林

2023-09-28

自 2018 年在降压药缬沙坦中发现亚硝胺杂质以来，问题不断升级，影响的产品范围不断扩大，包括一系列沙坦类药物，胃灼热药雷尼替丁和尼扎替丁，2 型糖尿病药物二甲双胍和西格列汀，结核药利福平和利福喷丁，戒烟药 Chantix……令全球监管机构和企业颇感棘手，应接不暇。各国监管机构陆续制定了药品生产、储存、供应链中亚硝胺形成风险评估的监管要求，当前，有效检测亚硝胺已成为确保原料药和药品质量的关键。

2023年7月，收载于《药物科学杂志》（Journal of Pharmaceutical Sciences） 的一篇题为Performance Characteristics of Mass Spectrometry-Based Analytical Procedures for Quantitation of Nitrosamines in Pharmaceuticals: Insights from an Inter-laboratory Study（文献具体解读）的文章中介绍了六个监管机构（分别来自美国、加拿大、法国、瑞士、德国和澳大利亚）的实验室进行的一项实验室间研究，各参与实验室用自己的分析程序来测定同一组样品中的亚硝胺含量，结果表明，可以通过多种分析程序实现痕量亚硝胺的精确定量，并深入挖掘基于质谱的分析程序在准确性、重复性和重现性方面的性能特征。

研究同时用到加标样品和真实样品

研究者掺入样品中用作参考标准的标准品：溶于甲醇的亚硝胺标准溶液，包括 NDMA（N-二甲基亚硝胺）、NDEA（N-二乙基亚硝胺）、NDIPA（N-亚硝基二异丙胺）和 NDBA（N-二丁基亚硝胺）、NMBA（N-亚硝基甲基-4-氨基丁酸）和 NEIPA（N-亚硝基乙基异丙胺），以及同位素标记的亚硝胺标准品。

FDA选择了两组样品分发给参与实验室，使用其内部经过验证的分析程序进行分析。

• 第一组样品：含无法检测出亚硝胺的氯沙坦和缬沙坦原料药和产品各一批，标记为 L-DS-0（氯沙坦原料药）、V-DS-0（缬沙坦原料药）、L-DP-0（氯沙坦产品）和V-DP-0（缬沙坦药品）。每个实验室在这些批次中准确添加了五个浓度水平（0.01、0.03、0.1、0.3 和 1 ppm）的亚硝胺标准品以及制备的不含任何加标亚硝胺的“安慰剂”样品。

• 第二组样品：受到不同程度的亚硝胺污染的氯沙坦和缬沙坦原料药和产品各三批，标记为L-DS-1、2、3（氯沙坦原料药），L-DP-1、2、3（氯沙坦药品），V-DS-1、2、3（缬沙坦原料药），以及V-DP-1、2、3（缬沙坦药品）。

文献提供具体分析方法参数和验证结果

表1总结了各实验室经验证可用于测定氯沙坦或缬沙坦原料药及产品中亚硝胺的分析程序中的关键组成部分。这些程序较好地代表了目前用于分析药物中亚硝胺的分析技术和定量方法。

表 1 参与实验室用于亚硝胺分析的分析程序的摘要

a. DCM：二氯甲烷

b. 0.1% 甲酸水溶液和 0.1% 甲酸甲醇溶液或纯甲醇是所有液相色谱分离所使用的两种流动相

c. SIM：选择离子监测

d. PRM：平行反应监测；基于高分辨率质谱的离子监测技术

e. MRM：多反应监测

f. (+)、(-)：表示质谱扫描的极性，(+)为正离子扫描，(-)为负离子扫描

g. 用于定量的 MRM 离子对

h. EMNA：N-亚硝基乙基甲胺

i. ILIS：同位素标记的内标

j. ppm: ng/mg API；亚硝胺相对API的浓度

加标样品分析LOD低至0.01ppm

通过评估加标样品分析的大型数据集，可以获得有关样品溶液中痕量亚硝胺定量分析的分析程序的性能特征的重要认知，包括精密度、准确度和定量限（LOQ）如下所述。

就重复性和重现性而言，%RSD 值通常随着亚硝胺加标浓度的增加而降低。在最低加标浓度 0.01 ppm 时，重复性和重现性的最大 %RSD 值分别为 18.4 和 29.3（不包括异常值）。随着加标浓度增加至 1 ppm，这些值分别降至 10 和 20。每个加标浓度下箱线图获得的最大 %RSD 值与 Horwitz 函数预测的值相当（表 2），Horwitz 函数是 Horwitz 从合作试验中得出的经验关系，用于描述重现性的相对标准偏差对浓度的依赖性。

表2 重复性和重现性 不同浓度下的 %RSD 值计算自Horwitz 函数（“Horwitz z function”列中的值）并从研究中获得（“Box Plot”列中的值）。研究中的值代表从按浓度分组的 %RSD 值箱线图中获得的最大 %RSD 值（不包括异常值）（图 3a 表示重复性，图 3d 表示重现性）

分析程序的准确性通常通过加标回收率来评估。562个偏差百分比值中有 96% 落在 -30 ~30 的范围内。值得注意的是，无论亚硝酸浓度水平如何，该范围都是一致的。因此，通过本研究中应用的技术量化痕量杂质的分析程序可以可靠地实现 70% 至 130% 的加标回收率。

定量限 (LOQ) 是杂质分析中分析程序的关键性能特征。ICH 指南提供了多种估计 LOQ的方法。在本研究中，LOQ 被评估为能够以可接受的准确性和精密度可靠地检测加标亚硝胺的最低浓度水平。0.01 ppm 的浓度是所检查的最低加标浓度，该水平的重复性、重现性和偏差百分比值与在较高浓度下观察到的值非常一致。考虑到大多数 %RSD 值均低于 15，并且 0.01 ppm 时的偏差百分比值介于 - 20 ~ 20 之间，因此可以合理地得出结论， LOQ低于 0.01 ppm可以实现。

真实样品分析结果存在一定差异

受污染的样品确实受到不同程度的 NDMA、NDEA 或 NMBA 污染。参与实验室对这些样品的分析反映了从样品制备到结果报告的整个分析程序的性能，并且是对加标样品分析的补充。对污染样品的分析总共计算了 91 个重复性 %RSD 值和 20 个重现性 %RSD 值。这些值总结在表 3 中，并按样品类型和这些样品中发现的特定亚硝胺类型进行分组。

表3 污染样品中亚硝胺分析的重复性 %RSD 和重现性 %RSD 值

* 未计算重复性 %RSD，因为报告的样品值少于三个。

- 未检测到亚硝胺。

受污染样品的重复性 %RSD 值范围与从加标样品中获得的值一致，其中 87% 的值（91 个值中的 79 个值）总数低于 10，表明在各自的实验室内进行从样品制备到结果报告的分析，每个实验室均可实现令人满意的亚硝胺分析重复性。与重复性相反，受污染样品的重现性 %RSD 值总体大于从加标样品获得的值。与加标样品中只有 4% 的重现性 %RSD 值超过 30 相比，污染样品中 45% （20 个值中的 9 个）的重现性 %RSD 值超过 30。

在 NMBA 及NDEA定量分析中均观察到不同实验室之间存在显著差异。受污染样品中观察到的实验室间巨大差异可归因于多种因素，包括样品制备程序、基质效应、样品中亚硝胺含量的不均匀分布以及有限的定量范围。这些因素强调了为每个特定样品基质开发合适的分析程序并验证其适当的定量范围的重要性。必须认识到的是，已证明对一种药品中的亚硝胺分析有效的分析程序不能自动假定对不同的制剂也有效。

总之，这项实验室间研究中对加标样品的分析表明，基于质谱的分析技术能够以可接受的准确度、精密度和重现性定量亚硝胺。研究中观察到的这些性能特征的范围为定量分析药物中痕量亚硝胺的分析程序的性能提供了参考。

作者：识林-白蜡

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